• 黃曲黴毒素(B1)ELLISA檢測試劑盒
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【概要】
黃曲黴毒素是曲黴菌屬的黃曲黴和寄生曲黴的二次代謝產物,是自然界最危險的致癌物質之一,廣泛存在於穀物、堅果、 棉籽以及以此為原料生產的各種食品、油料、酒類、飼料中,並能通過動物體產生同樣有害的代謝產物,存在於牛奶及奶製品, 肉類甚至人體血液,組織中。
黃曲黴毒素中毒性最強的是黃曲黴毒素 B1,是世界衛生組織規定的 I 類致癌物質,毒性是砒霜的 68 倍,其幾乎一直和黃曲黴毒素 B2、G1 和 G2 共存,是肝癌的三大致病因素之首。世界大部分國家和地區都已對食品和飼料中的黃曲黴毒素最高允許水平作了規定,因此,準確測定食品及飼料中的黃曲黴毒素含量對於食品安全監控具有重要意義。
【適用範圍】
可定性、定量檢測玉米、大米、麥類、豆類、花生、飼料、食用油等樣本中的黃曲黴毒素B1。
【試驗原理】
    本試劑盒采用競爭 ELISA 原理,在微孔板上預包被黃曲黴毒素 B1 抗原,加入樣本/黃曲黴毒素 B1 標準品溶液及辣根過氧 化物酶標記的黃曲黴毒素 B1 抗體。樣本或標準品溶液中的黃曲黴毒素 B1 與預包被在微孔板上的黃曲黴毒素 B1 抗原競爭結合 辣根過氧化物酶標記的黃曲黴毒素 B1 抗體。未結合的酶標抗體在洗滌時被除去。再加入 TMB 顯色液,讀取吸光值。樣本的吸 光值與其所含殘留物黃曲黴毒素 B1 的含量成負相關。對照標準曲線,即可得出相應殘留物黃曲黴毒素 B1 的含量。
【試劑盒靈敏度】
  試劑盒靈敏度:0.1ppb
【交叉反應率】
結構類似物 交叉反應率
黃曲黴毒素 B1 ……………………………………………      100%
黃曲黴毒素 B2 …………………………………………… 15%
黃曲黴毒素 G1 …………………………………………… 11%
黃曲黴毒素 G2 …………………………………………… 4%
黃曲黴毒素 M1 ……………………………………………
0.5%
【試劑盒組成】
1.96 孔板×1 塊
2.標準液×6 瓶:(2ml/瓶)
0ppb, 0.1ppb, 0.3ppb, 0.9ppb, 2.7ppb, 8.1ppb
3. 酶標物 1 瓶  ……………………………………………  7ml
4.顯色液 1 瓶  …………………………………………… 12ml
5.終止液 1 瓶  …………………………………………… 10ml
6.濃縮洗滌液 (10×)1 瓶  …………………………50ml
7.濃縮樣品稀釋液(10×)1 瓶 …………………… 50ml
【需要而未提供的設備及試劑】
設備:
┅微孔板酶標儀 450nm/630nm
 
┅振蕩器
┅氮吹儀
┅粉碎機
┅離心機
┅┅天平:感量 0.01g
┅┅微量移液器:單道 20µl~200µl、200µl~1000µl、八道移液器 300µl
試劑:
甲醇(分析純)
石油醚
去離子水(或蒸餾水)
三氯甲烷
NaCl
【試劑配製】
1.樣品稀釋液:將濃縮樣品稀釋液用去離子水按 1:9 體積比進行稀釋(1 份濃縮樣品稀釋液+9 份去離子水)。
2.洗滌工作液:將濃縮洗滌液用去離子水按 1:9 體積比進行稀釋(1 份濃縮洗滌液+9 份去離子水)。
3.穀物稀釋液:將 0.9gNaCl 用配製完成的樣品稀釋液溶解並定容至 100ml。
4.啤酒稀釋液:取甲醇,用配製完成的樣品稀釋液按 1:4 體積比進行稀釋(1 份甲醇+4 份樣品稀釋液)。
5.50%甲醇:取甲醇,用去離子水按 1:1 體積比進行稀釋(1 份無水甲醇+1 份去離子水)。
6.80%甲醇:取甲醇,用去離子水按 4:1 體積比進行稀釋(4 份無水甲醇+1 份去離子水)。
【樣本前處理步驟】
一、 穀物(大米、玉米、小米等低脂含量)(稀釋倍數:8)
1.取 1.0g 粉碎的樣品與 8ml 穀物稀釋液混合均勻(可根據實驗室條件等比例調節樣品與穀物稀釋液的量);
2.強力振蕩 3min;
3.5000g 離心 10min;
4.取上清液 100μl 待測 。
二、 蛋糕(稀釋倍數:10)
1.取 1.0g 粉碎的樣品與 4ml 50%甲醇混合均勻;
2.強力振蕩 3min;
3.5000g 離心 10min;
4.取 400μl 下層液體,加入 600μl 樣品稀釋液進行稀釋,充分混勻;
5.取 100μl 稀釋後液體待測 。
三、 花生、奶油蛋糕(稀釋倍數:10)
1.取 1.0g 粉碎的樣品與 4.0ml 石油醚混合均勻;
2.加入 4ml 50%甲醇混合均勻;
3.強力振蕩 3min;
4.5000g 離心 10min;
5.取 400μl 下層液體,加入 600μl 樣品稀釋液進行稀釋,充分混勻;
6.取 100μl 稀釋後液體待測 。
四、 食用油(稀釋倍數:10)
1. 取 1.0g 樣品與 4.0ml 石油醚混合均勻;
2.加入 4ml 50%甲醇混合,振蕩 1min;
3.靜置 10min;
4.取 400μl 下層液體,加入 600μl 樣品稀釋液進行稀釋,充分混勻;
5.取 100μl 稀釋後液體待測 。
五、 飼料、麵粉、湯圓(稀釋倍數:30)
1.取 5.0g 粉碎的樣品與 15.0ml 80%甲醇混合均勻(可根據實驗室條件等比例調節樣品與甲醇溶液的量);
2.強力振蕩 3min;
3.4000g 離心 10min;
4.取1ml上清液加入1ml 80%甲醇溶液混勻;
5.取混勻後液體 100μl,加入 400μl 樣品稀釋液,混合均勻;
6.取 100μl 稀釋後液體待測。
六、 啤酒(稀釋倍數:5)
1.   取 200μl 啤酒樣品(去除 CO2),加入 800μl 啤酒稀釋液(可根據實驗室條件等比例調節樣品與啤酒稀釋液的量);
2.   振蕩 3min;
3.   取 100μl 稀釋後液體待測。
七、醬油、醋、葡萄酒(稀釋倍數:8)
1.取 0.5ml 樣品,加入 0.5ml 蒸餾水並加入 4.0ml 三氯甲烷(可根據實驗室條件等比例調節樣品,水和三氯甲烷的量);
2.混勻振蕩 3min,5000g 離心 10min;
3.取 1.0ml 下層液,60℃氮氣吹幹;
4.加入 100μl 乙腈溶解幹燥物,並加入 900μl 樣品稀釋液,充分混勻;
5.取 100μl 稀釋後液體待測。
【檢測步驟】
一、 測定前須知:
1.使用之前將所有試劑和所需板條回溫(20~25℃)。
2.使用之後立即將所有試劑及剩餘板條放置 2~8℃,幹燥環境保存有利於保持試劑穩定性。3.ELISA 分析中的再現性,很大程度上取決於洗板的一致性,正確的洗板操作是 ELISA 操作中的要點。4.在所有恒溫孵育過程中,避免光線照射,用蓋板膜封住微孔板。
二、操作步驟:
1.將所需試劑及微孔板取出,放置室溫(20~25℃)30min 以上,液體試劑使用前均須搖勻。
2.取出所需數量的微孔板,將不用的微孔板與幹燥劑一起重新真空密封,放置於 2~8℃。不可冷凍。
3.洗滌工作液在使用前也需回溫。
4.將樣本和標準品對應微孔編號,每個樣本和標準品做 2 孔平行,並記錄標準孔和樣本孔所在的位置。
5.加標準品/樣本 50µl 到對應的微孔中,加入酶標物 50µl/孔,輕輕振蕩混勻,用蓋板膜蓋板後置室溫避光反應 15min。
6.小心揭開蓋板膜,用洗滌工作液充分洗滌,300µl/孔,洗板 5 次,每次間隔 30s,用吸水紙拍幹。
7.加入顯色液 100µl/孔,輕輕振蕩混勻,用蓋板膜蓋板後置室溫避光反應 15min。
8.加終止液 50µl/孔,輕輕振蕩混勻,設酶標儀於 450nm 處讀取每孔 OD 值。
【結果判定】
一、 粗略判定:
用樣品平均吸光度值與標準品吸光度值進行比較,就可以大體判斷出樣品中黃曲黴毒素 B1 的含量。如樣品平均吸光度值處於小於濃度為 0.3ppb 標準品的吸光度值,大於濃度為 0.9ppb 標準品的吸光度值,樣品稀釋倍數為 10,那麽可以粗略判定樣品中黃曲黴毒素 B1 的含量為 3ppb-9ppb。
二、 準確定量:
1.  百分吸光率的計算 標準品或樣本的百分吸光率等於標準品或樣本的百分吸光度值的平均值(雙孔)除以第一個標準(0 標準)的吸光度值, 再乘以 100%,即
黃曲黴毒素 B1  (Ⅰ型)ELISA 檢測試劑盒說明書
 
【概要】
黃曲黴毒素是曲黴菌屬的黃曲黴和寄生曲黴的二次代謝產物,是自然界最危險的致癌物質之一,廣泛存在於穀物、堅果、 棉籽以及以此為原料生產的各種食品、油料、酒類、飼料中,並能通過動物體產生同樣有害的代謝產物,存在於牛奶及奶製品, 肉類甚至人體血液,組織中。
 
黃曲黴毒素中毒性最強的是黃曲黴毒素 B1,是世界衛生組織規定的 I 類致癌物質,毒性是砒霜的 68 倍,其幾乎一直和黃曲黴毒素 B2、G1 和 G2 共存,是肝癌的三大致病因素之首。世界大部分國家和地區都已對食品和飼料中的黃曲黴毒素最高允許水平作了規定,因此,準確測定食品及飼料中的黃曲黴毒素含量對於食品安全監控具有重要意義。
【適用範圍】
 
可定性、定量檢測玉米、大米、麥類、豆類、花生、飼料、食用油等樣本中的黃曲黴毒素B1。
 
【試驗原理】
    本試劑盒采用競爭 ELISA 原理,在微孔板上預包被黃曲黴毒素 B1 抗原,加入樣本/黃曲黴毒素 B1 標準品溶液及辣根過氧 化物酶標記的黃曲黴毒素 B1 抗體。樣本或標準品溶液中的黃曲黴毒素 B1 與預包被在微孔板上的黃曲黴毒素 B1 抗原競爭結合 辣根過氧化物酶標記的黃曲黴毒素 B1 抗體。未結合的酶標抗體在洗滌時被除去。再加入 TMB 顯色液,讀取吸光值。樣本的吸 光值與其所含殘留物黃曲黴毒素 B1 的含量成負相關。對照標準曲線,即可得出相應殘留物黃曲黴毒素 B1 的含量。
【試劑盒靈敏度】
  
  試劑盒靈敏度:0.1ppb
 
【交叉反應率】
 
結構類似物 交叉反應率
黃曲黴毒素 B1 ……………………………………………      100%
黃曲黴毒素 B2 …………………………………………… 15%
黃曲黴毒素 G1 …………………………………………… 11%
黃曲黴毒素 G2 …………………………………………… 4%
黃曲黴毒素 M1 ……………………………………………
0.5%
 
【試劑盒組成】
 
1.96 孔板×1 塊
 
2.標準液×6 瓶:(2ml/瓶)
 
0ppb, 0.1ppb, 0.3ppb, 0.9ppb, 2.7ppb, 8.1ppb
 
3. 酶標物 1 瓶  ……………………………………………  7ml
 
4.顯色液 1 瓶  …………………………………………… 12ml
 
5.終止液 1 瓶  …………………………………………… 10ml
 
6.濃縮洗滌液 (10×)1 瓶  …………………………50ml
 
7.濃縮樣品稀釋液(10×)1 瓶 …………………… 50ml
 
 
【需要而未提供的設備及試劑】
 
設備:
┅微孔板酶標儀 450nm/630nm
 
┅振蕩器
┅氮吹儀
┅粉碎機
┅離心機
┅┅天平:感量 0.01g
 
┅┅微量移液器:單道 20µl~200µl、200µl~1000µl、八道移液器 300µl
 
試劑:
 
甲醇(分析純)
石油醚
去離子水(或蒸餾水)
三氯甲烷
NaCl
 
【試劑配製】
 
1.樣品稀釋液:將濃縮樣品稀釋液用去離子水按 1:9 體積比進行稀釋(1 份濃縮樣品稀釋液+9 份去離子水)。
 
2.洗滌工作液:將濃縮洗滌液用去離子水按 1:9 體積比進行稀釋(1 份濃縮洗滌液+9 份去離子水)。
 
3.穀物稀釋液:將 0.9gNaCl 用配製完成的樣品稀釋液溶解並定容至 100ml。
 
4.啤酒稀釋液:取甲醇,用配製完成的樣品稀釋液按 1:4 體積比進行稀釋(1 份甲醇+4 份樣品稀釋液)。
 
5.50%甲醇:取甲醇,用去離子水按 1:1 體積比進行稀釋(1 份無水甲醇+1 份去離子水)。
 
6.80%甲醇:取甲醇,用去離子水按 4:1 體積比進行稀釋(4 份無水甲醇+1 份去離子水)。
 
【樣本前處理步驟】
一、 穀物(大米、玉米、小米等低脂含量)(稀釋倍數:8)
 
1.取 1.0g 粉碎的樣品與 8ml 穀物稀釋液混合均勻(可根據實驗室條件等比例調節樣品與穀物稀釋液的量);
 
2.強力振蕩 3min;
 
3.5000g 離心 10min;
 
4.取上清液 100μl 待測 。
 
二、 蛋糕(稀釋倍數:10)
 
1.取 1.0g 粉碎的樣品與 4ml 50%甲醇混合均勻;
 
2.強力振蕩 3min;
 
3.5000g 離心 10min;
 
4.取 400μl 下層液體,加入 600μl 樣品稀釋液進行稀釋,充分混勻;
 
5.取 100μl 稀釋後液體待測 。
三、 花生、奶油蛋糕(稀釋倍數:10)
 
1.取 1.0g 粉碎的樣品與 4.0ml 石油醚混合均勻;
 
2.加入 4ml 50%甲醇混合均勻;
 
3.強力振蕩 3min;
 
4.5000g 離心 10min;
 
5.取 400μl 下層液體,加入 600μl 樣品稀釋液進行稀釋,充分混勻;
 
6.取 100μl 稀釋後液體待測 。
 
四、 食用油(稀釋倍數:10)
 
1. 取 1.0g 樣品與 4.0ml 石油醚混合均勻;
2.加入 4ml 50%甲醇混合,振蕩 1min;
 
3.靜置 10min;
 
4.取 400μl 下層液體,加入 600μl 樣品稀釋液進行稀釋,充分混勻;
 
5.取 100μl 稀釋後液體待測 。
 
五、 飼料、麵粉、湯圓(稀釋倍數:30)
 
1.取 5.0g 粉碎的樣品與 15.0ml 80%甲醇混合均勻(可根據實驗室條件等比例調節樣品與甲醇溶液的量);
 
2.強力振蕩 3min;
 
3.4000g 離心 10min;
4.取1ml上清液加入1ml 80%甲醇溶液混勻;
 
5.取混勻後液體 100μl,加入 400μl 樣品稀釋液,混合均勻;
 
6.取 100μl 稀釋後液體待測。
 
六、 啤酒(稀釋倍數:5)
 
1.   取 200μl 啤酒樣品(去除 CO2),加入 800μl 啤酒稀釋液(可根據實驗室條件等比例調節樣品與啤酒稀釋液的量);
 
2.   振蕩 3min;
 
3.   取 100μl 稀釋後液體待測。
 
七、醬油、醋、葡萄酒(稀釋倍數:8)
 
1.取 0.5ml 樣品,加入 0.5ml 蒸餾水並加入 4.0ml 三氯甲烷(可根據實驗室條件等比例調節樣品,水和三氯甲烷的量);
 
2.混勻振蕩 3min,5000g 離心 10min;
 
3.取 1.0ml 下層液,60℃氮氣吹幹;
 
4.加入 100μl 乙腈溶解幹燥物,並加入 900μl 樣品稀釋液,充分混勻;
 
5.取 100μl 稀釋後液體待測。
 
【檢測步驟】
 
一、 測定前須知:
 
1.使用之前將所有試劑和所需板條回溫(20~25℃)。
 
2.使用之後立即將所有試劑及剩餘板條放置 2~8℃,幹燥環境保存有利於保持試劑穩定性。
 
3.ELISA 分析中的再現性,很大程度上取決於洗板的一致性,正確的洗板操作是 ELISA 操作中的要點。
 
4.在所有恒溫孵育過程中,避免光線照射,用蓋板膜封住微孔板。
二、操作步驟:
 
1.將所需試劑及微孔板取出,放置室溫(20~25℃)30min 以上,液體試劑使用前均須搖勻。
 
2.取出所需數量的微孔板,將不用的微孔板與幹燥劑一起重新真空密封,放置於 2~8℃。不可冷凍。
 
3.洗滌工作液在使用前也需回溫。
 
4.將樣本和標準品對應微孔編號,每個樣本和標準品做 2 孔平行,並記錄標準孔和樣本孔所在的位置。
 
5.加標準品/樣本 50µl 到對應的微孔中,加入酶標物 50µl/孔,輕輕振蕩混勻,用蓋板膜蓋板後置室溫避光反應 15min。
 
6.小心揭開蓋板膜,用洗滌工作液充分洗滌,300µl/孔,洗板 5 次,每次間隔 30s,用吸水紙拍幹。
 
7.加入顯色液 100µl/孔,輕輕振蕩混勻,用蓋板膜蓋板後置室溫避光反應 15min。
 
8.加終止液 50µl/孔,輕輕振蕩混勻,設酶標儀於 450nm 處讀取每孔 OD 值。
 
【結果判定】
一、 粗略判定:
 
用樣品平均吸光度值與標準品吸光度值進行比較,就可以大體判斷出樣品中黃曲黴毒素 B1 的含量。如樣品平均吸光度值處於小於濃度為 0.3ppb 標準品的吸光度值,大於濃度為 0.9ppb 標準品的吸光度值,樣品稀釋倍數為 10,那麽可以粗略判定樣品中黃曲黴毒素 B1 的含量為 3ppb-9ppb。
 
二、 準確定量:

1.  百分吸光率的計算 標準品或樣本的百分吸光率等於標準品或樣本的百分吸光度值的平均值(雙孔)除以第一個標準(0 標準)的吸光度值, 再乘以 100%,即
                   B
百分吸光率(%)= --- ×100%
                   B0
B—標準溶液或樣本溶液的平均吸光度值
 
B0—0(ppb)標準溶液的平均吸光度值
 
2.標準曲線的繪製與計算
 
以標準品百分吸光率為縱坐標,黃曲黴毒素 B1 標準品濃度(ppb)的對數為橫坐標,繪製標準曲線圖。將樣本的百分吸光 率代入標準曲線中,從標準曲線上讀出樣本所對應的濃度,乘以其對應的稀釋倍數即為樣本中黃曲黴毒素 B1 實際含量。
【注意事項】
 
1.室溫低於 20℃或試劑及樣本沒有恢複到室溫(20~25℃)會導致所有標準的 OD 值偏低。
 
2.在洗板過程中如果出現板孔幹燥的情況,則會出現標準曲線不成線性,重複性不好的現象。所以洗板拍幹後應立即進行下 一步操作。
 
3.每種試劑使用前均需搖勻。
 
4.反應終止液為 0.5M 的硫酸,避免接觸皮膚。
 
5.不要使用過了有效期的試劑盒;也不要摻雜使用過了有效期的試劑盒;不要交換使用不同批號試劑盒中的試劑。
 
6.儲存條件: 試劑盒保存於 2~8℃,不能冷凍,將不用的微孔板重新真空密封。標準物質和無色的顯色劑對光敏感,因此要避光保存。
7.試劑變質的跡象:顯色試劑有任何顏色表明顯色劑變質,應當棄之。0 標準的吸光度(450/630nm)值小於 0.5(A450nm<0.5)時,表示試劑可能變質。
 
8.加入顯色液後,一般顯色時間為 15~30min。若顏色較淺,可延長反應時間到 35min(或更長),但不得超過 40min。 反之,則減短反應時間。
 
9.該試劑盒最佳反應溫度為 25℃,溫度過高或過低將導致檢測吸光度值和靈敏度發生變化。
 
【樣品最低檢測限】
    
    穀物 …………………………………………………   0.8ppb
蛋糕 …………………………………………………… 1ppb
花生、奶油蛋糕 ……………………………………   1ppb
食用油 ………………………………………………… 1ppb
飼料、麵粉、湯圓 ………………………………     2.4ppb
啤酒 …………………………………………………   0.5ppb
醬油、醋……………………………………………    0.8ppb
 
 
【貯藏條件及保存期】
  
    貯藏條件:保存試劑盒於 2~8℃。
 
保存期:該產品有效期為 12 個月。
 
 
 
B—標準溶液或樣本溶液的平均吸光度值
B0—0(ppb)標準溶液的平均吸光度值
2.標準曲線的繪製與計算
以標準品百分吸光率為縱坐標,黃曲黴毒素 B1 標準品濃度(ppb)的對數為橫坐標,繪製標準曲線圖。將樣本的百分吸光 率代入標準曲線中,從標準曲線上讀出樣本所對應的濃度,乘以其對應的稀釋倍數即為樣本中黃曲黴毒素 B1 實際含量。
【注意事項】
1.室溫低於 20℃或試劑及樣本沒有恢複到室溫(20~25℃)會導致所有標準的 OD 值偏低。
2.在洗板過程中如果出現板孔幹燥的情況,則會出現標準曲線不成線性,重複性不好的現象。所以洗板拍幹後應立即進行下 一步操作。
3.每種試劑使用前均需搖勻。
4.反應終止液為 0.5M 的硫酸,避免接觸皮膚。
5.不要使用過了有效期的試劑盒;也不要摻雜使用過了有效期的試劑盒;不要交換使用不同批號試劑盒中的試劑。
6.儲存條件: 試劑盒保存於 2~8℃,不能冷凍,將不用的微孔板重新真空密封。標準物質和無色的顯色劑對光敏感,因此要避光保存。
7.試劑變質的跡象:顯色試劑有任何顏色表明顯色劑變質,應當棄之。0 標準的吸光度(450/630nm)值小於 0.5(A450nm<0.5)時,表示試劑可能變質。
8.加入顯色液後,一般顯色時間為 15~30min。若顏色較淺,可延長反應時間到 35min(或更長),但不得超過 40min。 反之,則減短反應時間。
9.該試劑盒最佳反應溫度為 25℃,溫度過高或過低將導致檢測吸光度值和靈敏度發生變化。
【樣品最低檢測限】
穀物 …………………………………………………   0.8ppb
蛋糕 …………………………………………………… 1ppb
花生、奶油蛋糕 ……………………………………   1ppb
食用油 ………………………………………………… 1ppb
飼料、麵粉、湯圓 ………………………………     2.4ppb
啤酒 …………………………………………………   0.5ppb
醬油、醋……………………………………………    0.8ppb
【貯藏條件及保存期】
貯藏條件:保存試劑盒於 2~8℃。
保存期:該產品有效期為 12 個月。

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